斑馬魚胚胎顯微注射實驗操作方法

顯微注射技術(shù)是在顯微鏡下，利用顯微操作系統(tǒng)，控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動，對進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。該技術(shù)已經(jīng)在越來越多的實驗生物學(xué)研究領(lǐng)域中成為一項普遍的操作技術(shù)，并成功運用于包括小鼠、大鼠、兔子、斑馬魚及許多大型家畜，如牛、羊、豬等動物中。

斑馬魚顯微注射是將實驗材料直接注射到1-4細(xì)胞期的斑馬魚胚胎中，由于在這個胚胎發(fā)育早期沒有膜分隔細(xì)胞和卵黃，注入1個細(xì)胞或卵黃的溶液將擴(kuò)散到整個胚胎中。通過注射不同類型的實驗樣品，實現(xiàn)基因的瞬時過表達(dá)（over-expression）、表達(dá)敲減（knock-down）、以及制備轉(zhuǎn)基因或突變斑馬魚品系等研究。

一、   胚胎顯微注射技術(shù)的應(yīng)用

斑馬魚作為一種新興的理想的模式生物，在生命科學(xué)研究中已得到廣泛應(yīng)用，斑馬魚胚胎顯微注射技術(shù)是這些應(yīng)用研究的基礎(chǔ)技術(shù)平臺之一。通過顯微注射不同的實驗樣品，可以實現(xiàn)以下不同的目的。

（一）可以通過注射體外合成的mRNA實現(xiàn)目的基因的過表達(dá)，并通過觀察表型推測目的基因的功能。

（二）可以通過注射反義嗎啉環(huán)寡核苷酸（morpholino）敲減目的基因的表達(dá)。morpholino是穩(wěn)定的人工合成的核酸類似物，通過標(biāo)準(zhǔn)的堿基互補配對與mRNA結(jié)合，阻斷蛋白翻譯或mRNA剪切。與過表達(dá)相反，這種方法導(dǎo)致mRNA蛋白產(chǎn)物減少，可以通過該蛋白減少時對生物學(xué)過程的改變來解釋目的基因在發(fā)育中所扮演的角色。

（三）基因敲除（knock-out）品系的研制。基因敲除品系是在活體動物上開展基因功能研究的重要工具。CRISPR-Cas9技術(shù)是一種高效、快速的構(gòu)建敲除品系的新方法。這個技術(shù)的原理是通過人工設(shè)計出sgRNA，sgRNA能夠通過堿基配對識別目標(biāo)序列，然后引導(dǎo)體外合成的核酸內(nèi)切酶Cas9蛋白在目標(biāo)靶點產(chǎn)生切割。DNA斷裂后，細(xì)胞將通過非同源末端接合(NHEJ)修復(fù)機(jī)制來進(jìn)行修復(fù)，將斷裂的DNA重新連接起來，在這個過程中會產(chǎn)生DNA堿基的插入或缺失的錯誤，從而引起DNA突變。

（四）轉(zhuǎn)基因品系的研制。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體的性狀產(chǎn)生可遺傳的修飾。在轉(zhuǎn)基因品系研制中，轉(zhuǎn)基因載體是承載外源基因，攜帶靶基因進(jìn)入斑馬魚胚胎細(xì)胞，并將目的基因整合到斑馬魚基因組使其穩(wěn)定維持的DNA分子。顯微注射是制備轉(zhuǎn)基因斑馬魚過程中常用的方法。

二、 顯微注射系統(tǒng)的搭建

斑馬魚顯微注射需有一套相當(dāng)精密的顯微操作設(shè)備，主要包括以下幾種（圖4.1）：

圖4.1顯微注射常用設(shè)備。A: SUTTERP-1000微電極拉制儀; B: ASI顯微注射儀MPPI-3;

C: 持針器和顯微操作儀MM33; D：體視顯微鏡

微電極拉制儀用于拉制毛細(xì)管成注射針，可以調(diào)節(jié)的溫度、拉力、拉制時間等參數(shù)拉制出合適針尖的注射針，為了防止空氣中灰塵顆粒沾染注射針引起針尖阻塞，注射針現(xiàn)用現(xiàn)拉。

顯微注射儀用于注射針內(nèi)的溶液施加壓力脈沖，利用可調(diào)節(jié)氣壓脈沖將精準(zhǔn)體積的樣品注射至胚胎體內(nèi)。注射器還和一個腳踏板相連，使得實驗人員在使用雙手的同時還可以激活壓力脈沖將實驗材料注射入胚胎中；

持針器用于固定在注射過程中使用的注射針，并將它與注射器的空氣管相連，常裝在顯微操作器上；

顯微操作儀用于注射針的顯微操縱，可以在顯微注射過程中對注射針的位置進(jìn)行細(xì)小和精準(zhǔn)地調(diào)節(jié)；

體視顯微鏡用于顯微注射時觀察胚胎，可以在顯微注射過程中看到胚胎并對注射針?biāo)诘奈恢镁劢埂?/span>

三、 顯微注射過程及注意事項

顯微注射技術(shù)是一個相對精細(xì)的實驗操作，主要有以下步驟。

（一）準(zhǔn)備注射用的胚胎

注射的前1DAY，按照雌:雄為1:1或2 :1的比例將成年斑馬魚放置于配種缸，用隔板分開（圖2.3）。

注射的早上，抽去隔板，雌雄魚開始交配。一般在十多分鐘左右親魚產(chǎn)卵并使卵受精。一般一次抽板2缸魚左右，隨后根據(jù)實驗進(jìn)度適時給其它缸抽板?？稍诔榘迩跋葘?nèi)缸連同親魚換到另一干凈外缸中以節(jié)約清潔胚胎的時間。

親魚產(chǎn)卵后，取180μm孔徑的過濾網(wǎng)，收集外缸底部的魚卵，并用養(yǎng)殖水清洗魚卵2-3次。應(yīng)盡量收集20 min內(nèi)的受精卵（即對于同一缸親魚，兩次收集受精卵的時間間隔不得超過20分鐘，以保證發(fā)育階段的一致性）。受精卵分選和洗凈后，用吸管將收集的卵置于平板培養(yǎng)皿中，去除平皿內(nèi)的異物和胚胎周圍的水，采用干法注射。

胚胎在受精后10分鐘卵膜將膨脹，隨后數(shù)分鐘內(nèi)細(xì)胞形態(tài)變得較為規(guī)整（容易找到動物極），此時可以開始注射。受精后45分鐘左右（標(biāo)準(zhǔn)培育溫度下所需時間，具體情況同室溫有關(guān)）發(fā)生一次卵裂。樣品通常需要注射到1-4細(xì)胞時期胚胎，以下上樣、斷針、定量和注射都要在此段時間內(nèi)或在此之前完成。

（二）拉針、上樣和儀器準(zhǔn)備工作

1、拉針。使用微電極拉制儀拉制一定數(shù)量的毛細(xì)管，應(yīng)提前準(zhǔn)備。

2、可以提前準(zhǔn)備，樣品通常包括質(zhì)粒DNA、RNA、morpholino等。

DNA質(zhì)粒樣品：質(zhì)粒DNA需使用“去內(nèi)毒。素"的試劑盒提取。一般注射量為每枚胚胎20-150pg，多于200pg胚胎死亡率上升。

mRNA樣品：一般注射量為每枚胚胎10-500pg，針對不同的mRNA樣品，需要摸索各自適宜的濃度。

Morpholino樣品：參見GeneTools公司隨樣品提供的說明書。通常產(chǎn)品總量為300nmol一瓶，約相當(dāng)于2400μg，加入200μL滅過菌的去離子水（電阻率>18MΩ/cm）稀釋至12μg/μL，每管20μL分裝作為儲液凍存在－20℃。注射時取一管稀釋至0.5-6μg/μL (ng/nL)左右。針對不同的morpholino，需摸索各自合適的濃度，以獲得理想的表型而不產(chǎn)生毒性效應(yīng)為宜。在使用新的morpholino時，必須慎重考量該morpholino的有效性和特異性。

所有樣品使用前需要先離心，使可能存在的固體懸浮物沉淀到管底，避免堵住針頭。一般可以在注射樣品中加入終濃度10%-20%的酚紅，便于觀察注射過程。

3、上樣裝針。將拉制好的毛細(xì)管豎直固定。然后吸取1-3μl顯微注射液，逐滴地將注射液滴在毛細(xì)管頂端，在毛細(xì)管內(nèi)芯引導(dǎo)下，液體通過虹吸作用將匯聚于玻璃管針頭部分。如果使用的毛細(xì)管沒有內(nèi)芯，可以使用微量上樣移液槍頭上樣。上樣體積至少為1μL，一定不要在針內(nèi)引入空氣柱，否則會難以控制注射量。

4、打開顯微注射儀。以MPPI-3脈沖壓力注射儀為例。打開氮氣罐總閥，調(diào)節(jié)壓力至0-0.5之間。打開注射儀開關(guān)，調(diào)節(jié)主操作面板上的壓力值為10-20左右，選擇合適的注射壓力和脈沖時間。（圖4.2）

圖4.2 全套搭建好的顯微注射設(shè)備（左側(cè)）和破針操作（右側(cè)）

（三）注射斑馬魚胚胎

1、破針。將上好樣品的注射針插入持針器中固定，然后在體視鏡高倍放大率下，用尖頭鑷子將注射針的前端夾斷。（圖4.2）

2、注射劑量調(diào)整。把臺微尺放置到體視顯微鏡下，加入一滴礦物油，將注射針伸入礦物油中，踩動踏板壓將一滴注射液送到礦物油，測量注射樣品的大小。注射體積與針尖大小、注射壓力、注射時間、溶液粘度和外部壓力有關(guān)，理想的注射劑量為胚胎體積的10%，一般為1nL（注射樣品的直徑在10個小格左右）。注射劑量過大體積會損傷胚胎，過小可能影響定量精準(zhǔn)度和擴(kuò)散的均勻程度。

3、注射。將收集的胚胎放置到體視顯微鏡鏡下，用低倍物鏡對準(zhǔn)胚胎調(diào)焦，輕輕的落下針尖，并將注射針尖推入視野中心，通過微操作系統(tǒng)的微調(diào)調(diào)整注射針位置，直到清晰見到針尖為止。進(jìn)一步調(diào)整顯微鏡焦距和注射針及胚胎的位置，使胚胎和注射針尖均達(dá)到非常清晰程度。推動操縱桿，小心進(jìn)針，使注射針針尖進(jìn)入胚胎。腳踏開關(guān)將樣品注入胚胎。實驗結(jié)束時，先關(guān)閉氮氣罐總閥（逆時針變松為關(guān)），排空儀器中的氣體后，關(guān)閉總開關(guān)。

（四）注射胚胎的培養(yǎng)和觀察

1、胚胎養(yǎng)殖。注射結(jié)束后，將胚胎轉(zhuǎn)移至養(yǎng)殖水中，置入28?C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待胚胎發(fā)育2小時后，顯微鏡下挑出未受精的胚胎和死亡的胚胎。孵化期間每天要及時去除敗育胚胎，勤換水。

2、胚胎麻醉和固定。麻醉劑可以使魚類代謝減緩，鰓動頻率下降，氧的需求量減少，從而方便進(jìn)行實驗操作。通常將斑馬魚浸泡于0.016%的Tricaine中進(jìn)行麻醉。待胚胎麻醉后，利用4%的甲基纖維素固定胚胎，將胚胎調(diào)整到合適的位置。廢棄的顯微注射針的尖兒端燒溶后可以用于調(diào)整胚胎。

3、胚胎觀察。為了便于觀察顯微注射的結(jié)果，本次培訓(xùn)使用質(zhì)粒pT2(tpma:EGFP)和chordin mopholino作為注射練習(xí)的材料。質(zhì)粒pT2(tpma:EGFP)注射后，胚胎發(fā)育至1天時，在肌肉中特異表達(dá)綠色熒光蛋白；chordin mopholino注射后的胚胎出現(xiàn)腹部化（ventralization）。（圖4.3）

圖4.3 顯微注射后24hpf胚胎的照片。胚胎發(fā)育至1天時，注射質(zhì)粒pT2(tpma:EGFP)的胚胎在肌肉細(xì)胞中特異表達(dá)綠色熒光蛋白（A）；注射chordin mopholino的胚胎產(chǎn)生腹部化表型（B）。

顯微注射的注意事項

顯微注射的操作過程中有許多細(xì)節(jié)影響實驗的成功率，需要特別關(guān)注，主要包括以下幾方面。

1、注射樣品的質(zhì)量和和濃度。顯微注射的樣品種類繁多，包括mRNA、DNA或蛋白質(zhì)等，但是注射樣品是否純凈是關(guān)系到注射效率高低的重要因素之一。此外，注射樣品的濃度不易太高，例如注射DNA的總濃度一般控制在200pg以下。

2、注射前小心將顯微注射針定位，注射針定位到卵表面的注射角度是穿透堅硬的卵殼注射成功的關(guān)鍵。

3、破針時，將針尖一點點剪斷，不宜一次剪太多。顯微注射針尖如果太粗，會導(dǎo)致DNA流量過多，受精卵易于裂解；太細(xì)則導(dǎo)致針內(nèi)DNA流出速率過慢，且易堵塞針尖，而使DNA無法順利流入，影響注射效率。因此進(jìn)行顯微注射時，如何制備適用的顯微注射針是顯微注射效率極其重要的因素。

4、在注射過程中，常發(fā)生注射針堵塞，堵塞后，通?？赏ㄟ^輕夾針尖、增大輸出壓力或按pulse/CONT開關(guān)而得以緩解。如果不能解決，換用新的注射針。

5、注射時注射器的壓力不宜變化太快，否則會造成注射量操作難以控制，導(dǎo)致胚胎內(nèi)環(huán)境改變過快過大甚至脹破細(xì)胞。氮氣罐的壓力閥顯示氣體的壓力，壓力為0表明罐內(nèi)無氣體，需要及時換氣。

6、注射完畢，慢慢抽出注射針，要一氣呵成，避免受精卵內(nèi)物質(zhì)隨著毛細(xì)針抽出，造成受精卵的損傷。

7、在整個過程中，嚴(yán)禁將注射針尖對著人員和儀器，因為注射針在持針器上安裝不牢時或針尖堵塞，注射器、管子及注射針內(nèi)的壓力，可能將注射針射出傷人。